mRNA疫苗的主要挑战包括其易降解性和低转染效率。因此，递送系统在mRNA疫苗的功效中发挥着关键作用。目前，脂质纳米颗粒（LNPs）被公认为最有效且广泛使用的非病毒载体。LNPs由四种不同的脂质类组成，包括可离子化脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG化脂质。LNPs的粒径、电荷和脂质组成已被证明在静脉注射后显著影响其转染能力和生物分布。本研究旨在深入探讨LNPs的尺寸、表面电荷和PEG化脂质对其肌内注射mRNA递送效率的影响。

• LNPs的制备：

本研究制备了不同尺寸、电荷和PEG化脂质含量的LNPs。Luciferase mRNA（mLuc）被用作模型核酸分子包裹在LNPs中。

• 转染效率评估：

通过体外和体内实验评估了LNPs的转染效率。

利用荧光共振能量转移（FRET）技术标记完整纳米颗粒，监测LNPs在体内的分布。

在LNPs的众多特性中，尺寸无疑是一个关键因素。研究表明，LNPs的尺寸对其在体内的分布和转染效率具有重要影响。较小的LNPs往往具有更高的转染效率，因为它们更容易被细胞摄取，也更容易进入血液循环。具体来说，通过微流控混合技术制备的不同尺寸的LNPs，在体外和体内的转染实验中均表现出了显著的尺寸效应。较小的LNPs能够更有效地穿透细胞膜，将mRNA递送到细胞内，从而引发更高的蛋白表达水平。此外，较小的LNPs还具有更好的组织穿透性，能够更深入地渗透到目标组织中，提高基因治疗的疗效。

然而，值得注意的是，LNPs的尺寸并不是越小越好。过小的LNPs可能会导致稳定性下降，容易被体内的清除机制所识别并清除。因此，在制备LNPs时，需要权衡尺寸与稳定性之间的关系，找到最佳的平衡点。

图一、不同粒径LNP的体外细胞转染和体内表达和分布

除了尺寸之外，LNPs的表面电荷也是影响其递送效率的重要因素。根据研究，LNPs的表面电荷可以影响其与细胞膜的相互作用，进而影响细胞对LNPs的摄取效率。正电荷的LNPs通常具有更强的细胞摄取能力，因为它们能够与带负电的细胞膜发生静电相互作用，从而更容易被细胞捕获。然而，正电荷也可能导致LNPs在体内的稳定性下降，容易被血浆中的负电性物质所中和。相比之下，负电荷的LNPs虽然细胞摄取能力较弱，但具有更好的稳定性。它们能够在体内长时间保持结构完整，从而更有效地将mRNA递送到目标组织。此外，负电荷的LNPs还可以减少与血浆蛋白的非特异性结合，降低免疫原性。

当然，电荷对LNPs递送效率的影响并非绝对。在体内复杂的环境中，LNPs的表面电荷可能会受到血浆蛋白、细胞外基质等多种因素的影响而发生变化。因此，在制备LNPs时，需要根据具体的应用场景和需求来选择合适的电荷类型。

图二、不同电位LNP的体外细胞转染和体内表达和分布

PEG化脂质，即聚乙二醇化脂质，是LNPs中一种重要的表面修饰成分。通过引入PEG化脂质，可以显著提高LNPs的稳定性和循环时间，从而增强其递送效率。PEG化脂质能够延长LNPs的循环时间，主要是因为PEG分子具有亲水性和空间位阻效应。亲水性的PEG分子可以在LNPs表面形成一层保护膜，防止其与血浆蛋白等生物分子发生非特异性结合。而空间位阻效应则可以阻止免疫细胞对LNPs的识别和清除，从而延长其在体内的滞留时间。

此外，PEG化脂质的类型和含量也会对LNPs的递送效率产生影响。研究表明，PEG含量会影响LNP的封装效率稳定性。具体来说，LNP中PEGylated脂质的含量较低（如0.5 mol% DMG-PEG2k）会导致封装效率在四周内显著降低。相比之下，含有较高PEG含量的LNP表现出更稳定的封装效率。体内和体外实验均表明，1.5 mol% PEG含量的LNP展现出更高的转染效率。不同长度的PEG链会对LNPs的细胞摄取和转染效率产生不同的影响。较短的PEG链可以更容易地从LNPs表面脱落，从而释放出mRNA进行表达。而较长的PEG链则可能阻碍细胞对LNPs的摄取，降低转染效率。PEG化脂质具有较短酰基链的LNPs由于其优越的细胞摄取和溶酶体逃逸能力，有助于提高转染效率。

图三、PEG含量对LNP的体外细胞转染和体内表达和分布

图四、PEG种类LNP的体外细胞转染和体内表达和分布

研究发现，不同类型的PEG化脂质制备的脂质纳米颗粒（LNPs）在细胞转染效率上存在差异。通过DiD标记LNPs研究细胞摄取情况，发现PEG化脂质的酰基链长度和功能基团影响LNPs的细胞摄取。具体来说，含有DMG-PEG2k（酰基链较短）的LNPs在HEK293细胞中的摄取效率显著高于其他LNPs，这可能与酰基链长度导致的更快脱落效率有关。此外，功能基团也影响细胞摄取，DSG-PEG2k制备的LNPs摄取效率优于DSPE-PEG2k。研究还发现，虽然胎牛血清（FBS）影响细胞转染效率，但不同PEG化脂质形成的蛋白冠类型无显著差异，表明细胞摄取差异主要由酰基链长度和功能基团决定，与蛋白冠组成无关。使用抑制剂研究表明，不同PEG化脂质制备的LNPs的细胞摄取机制有所不同。同时，DMG-PEG2k制备的LNPs在HEK293和DC2.4细胞中的溶酶体逃逸效率也较高，且酰基链长度影响溶酶体逃逸效率，这与细胞摄取效率的趋势一致。溶酶体逃逸对LNPs的转染同样重要，因此DMG-PEG2k制备的LNPs表现出更高的转染效率。这些发现为LNP设计和基因递送应用提供了新见解，但关于PEG化脂质酰基链脱落的机制及其对LNP功能和性能的影响仍需进一步研究。

图五、不同PEG种类影响LNP的体外细胞转染的机制研究

本研究通过深入探讨LNPs的尺寸、表面电荷和PEG化脂质对其肌内注射mRNA递送效率的影响，填补了关键的知识空白。研究发现，较小尺寸的LNPs、具有中性电位的LNPs以及具有较短酰基链的PEG化脂质有助于提高转染效率。这些发现为LNPs在mRNA疫苗和其他基因治疗应用中的优化提供了重要指导。

【参考文献】

Kong, Weiwen, et al. "Role of size, surface charge, and PEGylated lipids of lipid nanoparticles (LNPs) on intramuscular delivery of mRNA." Journal of Nanobiotechnology 22.1 (2024): 553.