检测方法分享：包封率检测
mRNA疫苗在抗击新冠疫情的过程中，由于其设计与制造的简便性、固有的免疫原性、快速量产性，迅速成为了对抗新冠病毒的关键武器。在后疫情时代，mRNA疫苗在疾病预防和肿瘤治疗领域继续发挥着重要作用。但随着mRNA药物的快速发展，如何建立并完善针对mRNA产品的质量标准以保证mRNA疫苗产品的安全、有效和质量可控成为了行业内亟待解决的核心问题。
美国药典委员会(USP)与业内专家共同起草了《Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics》，为全球的mRNA治疗产品开发和生产企业提供公共分析方法以及标准的依据和技术资源，并先后于2022年2月和2023年4月对该草案进行了两次更新。
针对mRNA-LNP中比较重要的包封率（encapsulation efficiency）检测，小编今天会跟大家探讨下在mRNA-LNP的包封率检测中的一些问题。
一、为什么选择RiboGreen作为检测试剂
RiboGreen是一种用于定量检测溶液中RNA含量的超敏感荧光核酸染料，检测下限可以低至1ng/mL，并且不会受到样品中存在的蛋白，盐，洗脱剂，乙醇，琼脂糖等杂质的干扰。
二、RiboGreen检测mRNA-LNP原理
由于目前没有能够直接测量LNP内部包封RNA含量的方法，行业内普遍的方法需要把LNP内部的RNA释放出来；而不受乙醇、LNP组分干扰的RiboGreen染料是最适合的检测方式。
在整个mRNA-LNP包封率检测方法中，我们首先检测mRNA-LNP制剂中游离在LNP颗粒外的RNA（游离RNA）总量，接着使用Triton X-100破坏LNP结构释放RNA并检测溶液中全部的RNA总量（总RNA）。两者的差值就是LNP内部的包封的RNA总量。
三、选择单标曲还是双标曲
由于在整个检测过程中加入了Triton X-100来破坏LNP结构，因此需要对Triton X-100对RNA浓度检测的影响进行评估。
首先先对制剂稀释液、LNP组分、Triton-TE对RNA浓度的影响进行探究。
通过往RNA样品中加入单个组分，评估各组分对RNA浓度的影响，实验结果表明制剂稀释液、LNP组分对于RNA浓度检测几乎不存在干扰，加入Triton-TE的检测结果会比实际高20%-50%。
其次对不同浓度的Triton-TE对与RNA浓度检测结果进行探究。我们发现在1%-10%的浓度范围内，Triton-TE对于RNA浓度检测结果的影响基本保持一致。
图1：组分干扰实验
注：其中A组为制剂稀释液；B组为LNP成分；C组为Triton-TE；D组为制剂稀释液+Triton-TE
图 2：不同TritonX浓度对RNA浓度的影响
四、Triton-TE破乳时间的影响
我们挑选了2%浓度的Triton-TE来评估Triton-TE破乳时间对于总RNA浓度检测结果的影响。
使用2%浓度的Triton-TE进行破乳，在10-20min的破乳时间内，RNA浓度达到峰值并保持稳定，在30min时RNA浓度显著下降。对于RNA浓度的降低，猜测有一部分原因是RiboGreen染料的荧光被逐步降解，另外也可能是RNA与LNP发生了自组装。
图 3 ：破乳时间对RNA浓度的影响
五、RNA稀释倍数的影响
根据预测的样品浓度，破乳前后的样品采用不同的稀释倍数进行稀释，并比较不同稀释倍数下的游离RNA和总RNA的检测结果。
图 4 不同稀释倍数对游离RNA检测的影响
图 5 不同稀释倍数对总RNA检测的影响
结论
综上所述，我们发现Triton X-100在RiboGreen检测RNA浓度的过程中会形成干扰，因此有必要建立加入Triton-TE的RNA浓度标准曲线；同时在mRNA-LNP的包封率检测过程中，破乳时间、样品稀释倍数对于整个包封率检测结果都会有一定的干扰。在建立mRNA-LNP的包封率检测方法的同时，各位老师需要针对实际情况，对检测方法进行深入的研究以保证检测结果的准确性。